這種形式需要使用特定于該抗原不同表位的兩種不同抗體。這兩種抗體通常被稱為匹配抗體對。其中一種抗體包被于多孔板表面上并用作捕獲抗體以促進(jìn)抗原的固定，另一種抗體被酶偶聯(lián)并促進(jìn)抗原的檢測。ELISA試劑盒檢測未知抗原的雙抗體夾心法過程：

1、包被：用包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/mL。向每個(gè)Elisa板孔中加入0.1mL，4℃過夜孵育。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。

2、封閉：分別向各板孔中加入0.1mL的封閉液，37℃孵育1h，洗滌

3、加樣：分別加用稀釋液稀釋一定倍數(shù)的待檢樣品0.1mL和梯度稀釋后的抗原標(biāo)準(zhǔn)品0.1mL于上述已包被好的反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時(shí)，洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

4、加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入0.1mL新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(酶標(biāo)抗體的稀釋倍數(shù)需提前優(yōu)化測定)。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

5、加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入0.1mL新鮮配制的TMB底物溶液，37℃避光反應(yīng)10～30min。

6、終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入50uL的2M硫酸。

7、結(jié)果判定：將Elisa板置于酶標(biāo)儀上，于450nm處讀取各空的OD值，各孔分別減去空白對照孔的OD值進(jìn)行調(diào)零，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再分別計(jì)算各樣品的抗原含量。