細(xì)胞培養(yǎng)是生物醫(yī)學(xué)研究人員必須掌握的一項(xiàng)基本技能，是實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。所以，了解細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作要領(lǐng)，對(duì)生物醫(yī)藥科研工作者，特別是對(duì)基礎(chǔ)研究工作者來說，顯得尤為重要。文章從實(shí)際操作的角度談?wù)勼w外細(xì)胞培養(yǎng)操作要點(diǎn)。

一、試驗(yàn)前的準(zhǔn)備

一般細(xì)胞生長環(huán)境為5%的二氧化碳，37℃恒溫及飽和濕度。在細(xì)胞培養(yǎng)開始之前，實(shí)驗(yàn)人員必須查閱資料，了解細(xì)胞培養(yǎng)的習(xí)慣，如貼壁、半貼壁、懸浮物等。理解細(xì)胞生長的營養(yǎng)條件，大多數(shù)細(xì)胞為10%胎牛血清+89%培養(yǎng)液+1%抗生su。培養(yǎng)基的種類當(dāng)然很多，高糖、低糖、分化培養(yǎng)基、干細(xì)胞培養(yǎng)基等等。依據(jù)細(xì)胞生長條件，預(yù)選適宜的消耗材料，如促貼壁或低吸附培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板等。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行處理前，計(jì)算出這次處理所需的細(xì)胞生長培養(yǎng)基總量，并將生長培養(yǎng)基進(jìn)行配比。

二、細(xì)胞消化

與懸浮細(xì)胞相比，貼壁細(xì)胞的傳代步驟較多，應(yīng)避免不必要的細(xì)胞污染。傳代操作可以在細(xì)胞生長集中程度達(dá)到80-90%左右的時(shí)候進(jìn)行。由于細(xì)胞生長具有濃度依賴關(guān)系，過或過早傳代都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài)。取細(xì)胞培養(yǎng)盒， PBS清洗2次。此時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的液體吸凈，可采用真空泵、移液管、一次性吸管等，但無論采用何種吸凈方法，均應(yīng)避免操作手觸碰瓶口而造成污染，吸頭觸碰細(xì)胞面而造成細(xì)胞機(jī)械損傷。將液體吸凈，加入適量胰蛋白酶。胰酶不宜過多，只需少量滴在培養(yǎng)瓶上，傾斜培養(yǎng)可使細(xì)胞面覆蓋。細(xì)胞可以在這個(gè)時(shí)候放置在培養(yǎng)箱里，37℃條件下有利于胰蛋白酶的消化。大約2分鐘就可以消化了。自然地，有些細(xì)胞更容易消化，可能消化過程只需要30秒，如TC-1、MC-38等腫瘤細(xì)胞株；另一些則消化得更慢，如培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。如何判斷細(xì)胞消化過程是否已經(jīng)結(jié)束？在倒置顯微鏡下我們可以看到細(xì)胞的形態(tài)，大多數(shù)的細(xì)胞由多角形轉(zhuǎn)變?yōu)槁褕A形，可見細(xì)胞浮通過肉眼還可以直接觀察到細(xì)胞面從光滑到毛玻璃狀的變化。此可加入適量完全的培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，基本上可加3-5毫升。加水輕輕吹吸后移至離心管進(jìn)行離心，基本可將離心1000轉(zhuǎn)離心3分鐘即可分離細(xì)胞，轉(zhuǎn)速不宜過高，否則細(xì)胞碎片會(huì)隨離心下墜。離心性反應(yīng)后棄上清液。此時(shí)可直接倒入，然后用移液槍清洗殘余液體。

三、接種

對(duì)上述細(xì)胞沉淀物進(jìn)行重懸?？山柚谛郎u震蕩儀進(jìn)行重懸，也可在重懸細(xì)胞前用手指輕彈離心管底部，再加入適量的培養(yǎng)基重懸，切忌直接加入培養(yǎng)基后用移液槍吹干。在2-3個(gè)培養(yǎng)瓶中，將重懸好的細(xì)胞全部分離，補(bǔ)全生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。約8-10毫升的培養(yǎng)液用于T25培養(yǎng)，20-25毫升的培養(yǎng)液用于T75培養(yǎng)。注射后，十字混勻，每日鏡下觀察細(xì)胞狀況。傳代比例可根據(jù)細(xì)胞生長規(guī)律進(jìn)行調(diào)節(jié)，如快速生長的腫瘤細(xì)胞株，可按1:5甚至1:10的比例進(jìn)行傳代。但原代培養(yǎng)的細(xì)胞生長較慢，可在1:2甚至2:3傳代。