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腫瘤相關(guān)因子進口試劑盒說明書

試驗盒原理：
ES試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知ES濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將ES和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中ES的濃度呈比例關(guān)系。

特點：

一、高效、靈敏、特異的抗體;

二、穩(wěn)定的重復(fù)性和可靠性;

三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體;

四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型;

操作步驟：
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3． 加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5． 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8． 取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。

4、敏感度： 0.1 pg/ml。

結(jié)果判斷與分析：
1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的ES標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的ES含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍：0-240pg/ml

操作注意事項：
1． 試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
2． 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
9． 按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

ELISA常見問題與解決方法

1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果

① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當(dāng)導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。

② 酶標板洗滌不徹底——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。

③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當(dāng)濃度。

2．酶標板整體背景高

① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當(dāng)?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。

② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當(dāng)稀釋。

③ 反應(yīng)時間過長——當(dāng)酶標板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)，適當(dāng)縮短顯色時間。

④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。

⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。

3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差

① 樣品數(shù)量不整齊，加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。

② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。

③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。

4. 吸光值偏高或偏低

① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。

② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的最適用量。

③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當(dāng)延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。

④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進行孵育（一般37℃孵育1h）。