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細(xì)胞接收后的處理：
4）備注：運(yùn)輸用的培養(yǎng)基（灌液培養(yǎng)基）不能再用來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞，請(qǐng)換用按照說(shuō)明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的完全培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。收到細(xì)胞后次傳代建議T25培養(yǎng)瓶1：2傳代。
英文簡(jiǎn)稱
規(guī)格
貨號(hào)
NCI-H446:NCIH446
1×106
P-X889
產(chǎn)品詳情：
生長(zhǎng)特性
半貼半懸
細(xì)胞形態(tài)
上皮細(xì)胞樣
凍存條件
凍存液：55% 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO
溫度：液氮
培養(yǎng)方案A（默認(rèn)）
生長(zhǎng)培養(yǎng)基:
RPMI-1640＋10% FBS＋1% P/S
培養(yǎng)條件:
氣相：空氣，95%；CO2，5%, 溫度：37℃
推薦傳代比例 1:3-1:4
推薦換液頻率 2-3次/周
參考資料(來(lái)源文獻(xiàn))
背景描述 NCI-H446細(xì)胞是從一位小細(xì)胞肺癌患者的胸水中建立的，NCI-H446細(xì)胞的原始形態(tài)并不具有小細(xì)胞肺癌特征。NCI-H446細(xì)胞是小細(xì)胞肺癌的生化和形態(tài)學(xué)上的變種，表達(dá)神經(jīng)元特有的烯醇酶和腦部肌酸激酶同功酶。NCI-H446細(xì)胞內(nèi)多巴脫羧酶、蠶素、抗、催產(chǎn)素或胃泌釋放肽未達(dá)到可檢測(cè)水平。C-myc DNA序列擴(kuò)增約20倍，c-myc RNA比正常細(xì)胞增加15倍。初，傳代培養(yǎng)基用RPMI-1640(含5%胎牛血清、10nM氫化可的松、0.005mg/ml胰島素、0.01mg/ml鐵傳遞蛋白、10nM 17-β-雌二醇、30nM亞硒酸鈉)。
年齡（性別）
男性；61歲
組織來(lái)源
肺；轉(zhuǎn)移灶：肋膜滲出癌；小細(xì)胞肺癌
細(xì)胞類型
腫瘤細(xì)胞
腫瘤類型
肺癌細(xì)胞
生物等級(jí) BSL-1
致瘤性 Yes, in nude mice (The cells form transplantable tumors with
non-typical SCLC histology).
保藏機(jī)構(gòu) ATCC; HTB-171
1）收到細(xì)胞后，75%酒精瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置約2-3h，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶破損、有液溢出及細(xì)胞有污染，請(qǐng)拍照后及時(shí)聯(lián)系我們。
2）請(qǐng)?jiān)?或5X顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)給剛收到的細(xì)胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養(yǎng)瓶外觀照片一張留存，作為售后時(shí)收到時(shí)細(xì)胞狀態(tài)的依據(jù)。
3）貼壁細(xì)胞：細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)和貼壁情況，有些貼壁細(xì)胞在快遞運(yùn)送過(guò)程中會(huì)因振動(dòng)脫落和脫落后成團(tuán)的情況。若鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)密度若在60%以下，可去除培養(yǎng)瓶中灌液培養(yǎng)基（若有未貼壁的細(xì)胞需要離心回收，重懸打入到原培養(yǎng)瓶中）,加入新配制的完全培養(yǎng)基6-8mL，放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。若細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%-80%以上，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。傳代過(guò)程中，若因運(yùn)輸振動(dòng)脫落的細(xì)胞需要離心回收。
干冰運(yùn)輸及復(fù)蘇好存活細(xì)胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運(yùn)輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮或直接復(fù)蘇，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。（2）T25瓶復(fù)蘇的存活細(xì)胞常溫發(fā)貨，收到后按照細(xì)胞接收后的處理方法操作。
1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。
二．細(xì)胞處理：
1）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過(guò)夜
。天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況和細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：1、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2、加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來(lái)終止消化。
3、輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說(shuō)明書要求配置的新的完全培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長(zhǎng)活力，后續(xù)傳代根據(jù)實(shí)際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。
3）細(xì)胞凍存:收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時(shí)凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。下面T25瓶為例：
1、細(xì)胞凍存時(shí)按照細(xì)胞傳代的過(guò)程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，來(lái)決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/ml.
2、1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×10?~1×10?個(gè)活細(xì)胞/ml分配到一個(gè)凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。
3、將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過(guò)夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲(chǔ)存。同時(shí)記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。
實(shí)驗(yàn)原理：
公司正在出售的產(chǎn)品：
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鋅指蛋白801抗體 |
鴨子磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
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MAZ |
活體細(xì)胞半胱-10（CASPASE-10）活性原位熒光染色檢測(cè)試劑盒 |
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脫氧鳥(niǎo)苷激酶抗體 |
HumanGalactoseELISAKit |
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DGUOK |
人半乳糖(Galactose)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
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人B細(xì)胞受體相關(guān)蛋白31(BCAP31)elisa檢測(cè)試劑盒 |
pAMPK ELISA Kit |
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大鼠C肽(C-Peptide)elisa檢測(cè)試劑盒 |
NOSTRIN |
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小鼠尿微量白蛋白(ALB)elisa檢測(cè)試劑盒 |
通用轉(zhuǎn)錄因子III/WBSCR11抗體 |
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一氧化氮合酶轉(zhuǎn)運(yùn)誘導(dǎo)抗體 |
GTF2IRD1 |
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PE-CY5標(biāo)記的鼠抗人IgG H&L單克隆抗體 |
酪蛋白硫酸轉(zhuǎn)移酶1抗體 Anti-TPST1 |
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Mouse Anti-Human IgG H&L (3D3) mAb / PE-Cy5 |
細(xì)胞色素P450 1A2抗體 Anti-P450 1A2/CYP1A2 |
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FAM9B蛋白抗體 |
磷酸化蛋白激酶C nu型抗體 Anti-phospho-PRKD3(Ser41) |
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FAM9B |
亞砷鹽相關(guān)蛋白抗體 Anti-Spindly/CCDC99 |
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人c-jun elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
小鼠凝血酶受體(TR)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
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Humanc-junELISAKit |
NCI-H446人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞TRELISAKit |
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大鼠β2整合素(ITG β2/CD11+CD18)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
人核糖體蛋白S25(RPS25)elisa分析檢測(cè)試劑盒 |
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ITG β2/CD11+CD18 Elisa Kit |
RPS25ELISAkit |
實(shí)驗(yàn)步驟：
1 將目的基因構(gòu)建到合適的慢病毒載體上，利用293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，獲得含目的基因的慢病毒；
2 轉(zhuǎn)染前24 h進(jìn)行細(xì)胞鋪板，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度控制在80%左右；
3 天加入適量病毒懸液感染細(xì)胞，并置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育；
4 24 h后用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)；
5 在轉(zhuǎn)染3-4天后開(kāi)始加藥篩選培養(yǎng)，直至顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞比例為100%，獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。